Centralni laboratorij

Vrhunski opremljen Centralni laboratorij nudi sve sadržaje nužne za provedbu R&D projekata putem ugovornog istraživanja.

Sastoji se od 6 laboratorijskih jedinica:

Djelatnice mikrobiološkog laboratorija:

Dr. sc. Adriana Lepur, voditeljica laboratorija, e-mail: adriana.lepur@biocentre.hr
Matea Skoblar, mag. ing., mlađa stručna suradnica, e-mail: matea.skoblar@biocentre.hr

Usluge Mikrobiološkog laboratorija usmjerene su na proizvodnju i pročišćavanje rekombinantnih proteina (µg do mg), te razvoj procesa proizvodnje proteina, biofarmaceutika i bio-sličnih lijekova. Nudimo uzgoj, održavanje i pohranjivanje kultura bakterija i kvasaca.

U Mikrobiološkom laboratoriju provode se i praktične edukacije.  

TRANSFORMACIJA BAKTERIJSKIH STANICA

Kompetentne stanice E. coli transformiramo metodom toplinskog šoka kako bi unijeli vektor sa željenom DNA. Transformirane stanice odaberemo na selektivnoj agarnoj podlozi te pripremamo uzorak stanica u glicerolu za duboko zamrzavanje i daljnje korištenje.

UMNAŽANJE I PROČIŠĆAVANJE PLAZMIDA

Kompetentne stanice E. coli transformiramo željenom DNA. Nakon izolacije DNA (mini, midi ili maxi prep) provodimo kontrolu kvalitete koja uključuje: razdvajanje DNA na agaroznom gelu, omjer absorbancije A260/280 i kvantifikaciju.

PROIZVODNJA BIOMASE ILI PROTEINA U E. COLI ILI KVASCIMA

Proizvodnja rekombinantnih proteina započinje transformacijom i uzgojem stanica u odabranim uvjetima. Izvedba fermentacije može biti u tikvama od 0,1-1 L, ili u fermentorima od 0,5 L (do 12 istovremeno), 2 L (2 istovremeno) ili 30 L. Prije fermentacije većih količina (2-30 L) provodimo testnu proizvodnju u volumenu od 0,1 L. Uvećani prinos rekombinantnog proteina postižemo optimizacijom uvjeta proizvodnje – odabirom hranjivog medija, izvora ugljika, temperature, pH, prozračivanja, koncentracije kemijskog induktora te ukupnim trajanjem procesa.

PROČIŠĆAVANJE PROTEINA

Ovo je usluga našeg Laboratorija za izolaciju i pročišćavanje. Proces uključuje razbijanje stanica (visokotlačnim ili ultrazvučnim homogenizatorom), te razdvajanje, izolaciju i pročišćavanje proteina različitim kromatografskim tehnikama. Provodi se i koncentriranje uzoraka i/ili dijafiltracija (odsoljavanje i izmjena pufera).

KONTROLA KVALITETE PROTEINA

Ovo je usluga našeg Laboratorija za bioanalitiku – proteomiku.
Laboratorij nudi SDS-PAGE i western-blot analizu proteina tijekom cijelog proizvodnog procesa – od optimizacije proizvodnje do prijenosa proizvodnje na veliku skalu. Uključuje i spektrofotometrijsku kvantifikaciju proteina, te identifikaciju metodom LC-MS/MS.

MOLEKULARNA BIOLOGIJA

Osim izolacije proteina provodimo i izolaciju DNA i RNA iz stanica mikroorganizama. Metodom lančane reakcije polimerazom (PCR) možemo detektirati i ciljano identificirati mikroorganizme u raznim uzorcima, primjerice probioticima, hrani ili napitcima (pivo, vino, sokovi).

INSTRUMENTI I OPREMA

Bioreaktori:

BIOSTAT Qplus 12 x 0.5 L MO, BIOSTAT B Twin 2 L MO, BIOSTAT Cplus 30 L MO (Sartorius).

Homogenizatori:

visokotlačni homogenizator Panda Plus (Gea Niro Savi); ultrazvučni homogenizator Bandelin (Sonoplus).

NanoDrop One spektrofotometar (Thermo Scientific); protočna centrifuga (Sorval Stratos).

Dodatnu raspoloživu opremu možete pronaći u našem Laboratoriju za izolaciju i pročišćavanje i Bioanalitičkom laboratoriju II (Proteomika).

Djelatnik laboratorija za staničnu biologiju:

Dr. sc. Marko Marjanović, viši stručni suradnik, e-mail: marko.marjanovic@biocentre.hr

Laboratorij za staničnu biologiju pruža uslugu uzgoja stanica i ekspresije rekombinantnih proteina u laboratorijskim i poluindustrijskim razmjerima u odvojenim i paralelnim bioreaktorskim sustavima. Nudimo usluge razvoja procesa i vođenje banke stanica, izvodimo različite vrste biokemijskih i staničnih analiza i ispitivanja koristeći standardne tehnike u molekularnoj biologiji (npr. protočna citometrija, PCR…).

PROTOČNA CITOMETRIJA

Protočna citometrija sa 3 lasera (BD FACSVerse; 405, 488 i 633 nm), max. 8 fluorokoma po uzorku. Imunofenotipizacija (površinsko i unutarstanično bojanje), hematološka analiza, proučavanje imunodeficijencije, odbijanje transplantanata, specifični ljudski ili animalni površinski ili unutarstanični markeri, validacija staničnih linija, apopoptoza/nekroza, testovi vijabilnosti stanica, vizualizacija fluorescentnih proteina, kvantifikacija uspješnosti transfekcije, mjerenje proliferacijskih markera, kemotaksija, polimerizacija aktina, analiza sadržaja DNA, analiza staničnog ciklusa, aktivnost kaspaza, depolarizacija mitohondrija, određivanje oksidacijskog stresa stanica i mitohondrija, analiza FCS podataka u FlowJo programu.

UZGOJ STANIČNIH LINIJA I TESTOVI NA LABORATORIJSKOJ SKALI

Nudimo usluge uzgoja ljudskih i animalnih staničnih linija (adherentnih ili u suspenziji), primarnih kultura, kokultura, 3D kultura, usluge banke stanica, generacija nurse-like stanica ili sličnih in vitro staničnih modela, testove citotoksičnosti i testove stanične proliferacije (MTT, MTS, XTT, direktni kontakt i slično) i test sposobnosti formiranja kolonija.

UZGOJ STANIČNIH LINIJA NA POLUINDUSTRIJSKOJ SKALI

U laboratoriju možemo uzgojiti stanične linije u bioreaktorima volumena 0.5L (do 12 paralelnih), 2L (do 2 paralelna), ili 30L za optimizaciju procesa i proizvodnju rekombintantnih proteina, proizvodnju lijekova, citokina, hormona rasta, hematopoetskog faktora rasta, antitijela, itd.

IZOLACIJA I PROČIŠĆAVANJE PROTEINA SE PROVODI U NAŠEM LABORATORIJU ZA IZOLACIJU I PROČIŠĆAVANJE

Izolacija i pročišćavanje uključuje lizu stanica (visokotlačna homogenizacija i ultrazvučna homogenizacija), separaciju i pročišćavanje proteina. Osim navedenog, u ovom laboratoriju pružamo i usluge desalinizacije, izmjene pufera i ukoncentriravanje uzorka.

KONTROLA KVALITETE PROTEINA SE PROVODI U NAŠEM BIOANALITIČKOM LABORATORIJU II – PROTEOMIKA

Kontrola kvalitete uključuje SDS elektroforezu i Western blot analizu rekombinantnih proteina te NanoDrop kvantifikaciju, LC-MS/MS mapiranje proteina i identifikaciju proteina.

MOLEKULARNA BIOLOGIJA

Osim navedenih usluga uzgoja stanica, nudimo i usluge ekstrakcije DNA, RNA i proteina iz stanica tkiva, staničnih suspenzija, krvi, koštane srži itd., Western blot analize, PCR, ELISA, generacije lentiviralnih i adenovirusnih vektora, transformaciju stanica tranzijentnom ili stabilnom transfekcijom, CRISPR/CAS9 sistemom modificiranja genoma i sl.

INSTRUMENTI I OPREMA

BD FACSVerse protočni citometar (3 lasera: 405, 488 i 633 nm); Fermentori (Sartorius BIOSTAT QPlus 12 fold 0.5L CC, BIOSTAT B Twin 2L CC, BIOSTAT C Plus 30L CC); Hidex Chameleon čitač mikrotitarskih pločica; Applied Biosystems SimplyAmp thermal cycler; Sorval Stratos protočna centrifuga, Beckman Coulter Vi-Cell XR brojač stanica.

Djelatnice laboratorija za izolaciju i pročišćavanje:

Marina Markeš, mag. chem., voditeljica laboratorija, e-mail: marina.markes@biocentre.hr
Marija Gunjača, mag. nutr., pripravnica, e-mail: marija.gunjaca@biocentre.hr

Usluge laboratorija za izolaciju i pročišćavanje usmjerene su na procesiranje biološkog materijala poput izolacije bioloških molekula, nativnih ili rekombinantnih proteina iz uzorka. Nudimo usluge optimizacije i skaliranja procesa od laboratorijskih do industrijskih mjera.

IZOLACIJA I PROČIŠĆAVANJE SMJESA

Tehnikama tekuće preparativne kromatografije iz uzorka se odvajaju proteini ili male molekule. Ovisno o fizikalno-kemijskim svojstvima uzorka i analita  koristi se prikladna vrsta tekućinske kromatografije – npr. ionska izmjena (engl. ion exchange), kromatografija isključenja (engl. size exclution chromatography), afinitetna kromatografija, kromatografija obrnutih faza (engl. reversed-phase chromatography) itd.

Analizu je moguće provesti ciljano, tako da se iz uzorka izolira jedan ili više ciljanih analita, ili tako da se kompleksna smjesa razdvoji prema određenom svojstvu (recimo prema ionskoj jakosti ili veličini molekula) nakon čega se sakupe manje frakcije, spremne za daljnju karakterizaciju.

UKONCENTRIRAVANJE I DIJAFILTRACIJA

Primjena tangencijalne filtracije (engl. cross-flow) za ukoncentriravanje i izmjenu pufera u uzorcima velikog volumena (od 0.5 L do nekoliko desetaka litara).

PROCESIRANJE na različitim skalama

U laboratoriju se procesiranje može provoditi na različitim skalama – od manjih, laboratorijskih količina do većih količina na pilotnoj proizvodnoj skali. Metoda za izolaciju i pročišćavanje se razvija i optimizira na manjoj skali, a zatim se transferira na veću.

INSTRUMENTI I OPREMA

Sustavi za preparativnu kromatografiju:

ÄKTA Avant 25, GE Healthcare Life Sciences

ÄKTA Avant 150, GE Healthcare Life Sciences

ÄKTA Pilot, GE Healthcare Life Sciences

Sustavi za tangencijalnu filtraciju:

ÄKTA Crossflow, GE Healthcare Life Sciences

SARTOFLOW Advanced, Sartorius

Djelatnice bioanalitičkog laboratorija I (kemija):

Dr. sc. Anita Šporec, voditeljica laboratorija, e-mail: anita.sporec@biocentre.hr
Iva Bebek, mag. ing., viša stručna suradnica, e-mail: iva.bebek@biocentre.hr
Diana Nejašmić, mag. ing., mlađa stručna suradnica, e-mail: diana.nejasmic@biocentre.hr

Portfelj usluga Bioanalitičkog laboratorija I (kemija) BICRO BIOCentra obuhvaća razvoj, optimizaciju, transfer i / ili validaciju analitičkih metoda. Pri tome se koriste tehnike spektroskopije (UV/VIS), tekućinske kromatografije (UHPLC-UV/VIS, HPLC-RID, HPLC-FLD, LC-(QQQ)-MS/MS) i plinske kromatografije (GC-FID, GC-MS/MS).

Naš multidisciplinarni tim stručnjaka specijaliziran je za razvoj novih analitičkih metoda i unaprjeđenje postojećih, identifikaciju nedostataka i rješavanje analitičkih problema. Razvijene metode uspješno su implementirane u brojne projekte iz područja farmaceutske i prehrambene industrije, kao i biomedicine i biotehnologije.

Naši klijenti koji podjednako dolaze iz akademske zajednice kao i iz farmaceutske odnosno prehrambene industrije često zbog nedostatka vremena, opreme ili specifičnih znanja ne mogu samostalno riješiti složene analitičke probleme. Mi pružamo detaljne protokole za razvoj, validaciju i / ili transfer analitičkih metoda, te otvoreno surađujemo s klijentima u cijelom procesu.

Bioanalitički laboratoriji I (kemija) uspješno provodi praktične radionice iz područja plinske i tekućinske kromatografije. Raspored radionica i potpuni opis možete pronaći na linku BIOEdukacije. Uz opće kromatografske radionice, moguća je priprema i održavanje personaliziranih edukacija iz područja kromatografije i spektrometrije masa prema zahtjevu i specifičnim potrebama klijenta.

INSTRUMENTI I OPREMA

Agilent Technologies HPLC-DAD-UV/VIS

Razvoj i validacija kvantitativnih metoda za analizu sadržaja aktivne djelatne tvari (API) i onečišćenja u gotovim proizvodima iz farmaceutske industrije.

Analiza biološki aktivnih tvari, konzervansa, antioksidansa, aditiva, vitamina topljivih u vodi, organskih kiselina u biljnom materijalu i hrani.

Analiza metabolita u biološkom materijalu (stanični lizat, biomasa).

Agilent Technologies HPLC-RID

Određivanje sadržaja šećera i složenih ugljikohidrata, alkohola i viših alkohola u hrani i biološkom materijalu.

Određivanje veličina molekula kromatografijom isključenja (SEC).

Agilent Technologies HPLC-FLD

Analize spojeva koji prirodno fluoresciraju (npr. policiklički aromatski ugljikovodici) kao i fluorescentni spojevi dobiveni pred kolonskom derivatizacijom (npr. biogeni amini, sadržaj aminokiselina).

Agilent Technologies LC-(QQQ)-MS/MS

Ciljane analize tragova organskih spojeva u kompleksnim matriksima.

Analize kvalitete i sigurnosti hrane (npr. akrilamid u raznim vrstama hrane).

Analize uzoraka iz okoliša.

Istraživanja metabolita lijekova, toksikologije, forenzike (npr. nitrozamini u gotovim farmaceutskim proizvodima).

Analize bioloških uzoraka (npr. male toksične molekule u biološkim tekućinama).

Agilent technologies GC-FID

Kvantitativna analiza alkohola u alkoholnim pićima, određivanje masnih kiselina u dodacima prehrani, kvantitativno određivanje sadržaja ulja u emulziji farmaceutskog pripravka.

Thermo Scientific GC-MS/MS

Određivanje aroma (aroma profil) hrane, pića, napitaka, začina i mirisa.

Određivanje sastava esencijalnih ulja (npr. lavanda, limun).

Analiza hlapljivih organskih spojeva (npr. estera, alkohola, aldehida, terpena), onečišćenja u tragovima i zagađivala u hrani.

Analiza hlapljivih lipofilnih spojeva u biljnim vrstama, parfemima isl. (npr. mentol).

Razvoja metoda za određivanje metaboličkih profila; identifikacija spojeva nastalih metabolizmom mikroorganizmima, metabolita u biološkim tekućinama, profil masnih kiselina u serumu.

Cary 100 UV/VIS spektrofotometar

Specifične analize boje i gorčine npr. craft pive.

Određivanje antioksidativne aktivnosti, ukupnih fenola, ukupnih ugljikohidrata u biljnim materijalima i hrani.

Djelatnice bioanalitičkog laboratorija II (proteomika):

Dr. sc. Ana Butorac, voditeljica laboratorija, e-mail: ana.butorac@biocentre.hr
Rea Bertoša, mag. ing., stručna suradnica, e-mail: rea.bertosa@biocentre.hr

Usluge bioanalitičkog laboratorija II (proteomika) usmjerene su na karakterizaciju pojedinačnih proteina te analizu kompleksnih proteinskih smjesa (putem ciljanih i ne-ciljanih analiza). U našem laboratoriju se također može analizirati i struktura višeg reda proteina. Već niz godina održavamo praktične radionice i personalizirane edukacije za naše korisnike.

KARAKTERIZACIJA PROTEINA

Mapiranje peptida

Mapiranje masa peptida uključuje fragmentaciju proteinske molekule koristeći specifične enzime, a zatim analizu dobivene smjese peptida koristeći metode tekućinske kromatografije (LC) i/ili spektrometrije masa (MS). Analize mogu biti napravljene direktnim MS mjerenjem ili putem spregnutih sustava tekućinske kromatografije i spektrometrije masa (LC-MS). Kako bi se dobila potvrda o primarnoj strukturi proteina, mapiranje peptida može biti prošireno pretragom baze podataka ili sekvenciranjem peptida de novo.

Analize molekulske mase

Mjerenja intaktne molekulske mase proteina bazirane na MS metodama nude točnost u mjerenju u širokom području molekulskih masa. Direktne MALDI-MS analize koriste se pri analizi pojedinačnih proteina, dok se u kompleksnim smjesama pristupa separaciji tekućinskom kromatografijom prije MALDI-MS detekcije. Molekulska masa proteina te karakterizacija nečistoća u proizvodima biofarmaceutike može se provesti tekućinskom kromatografijom (gel filtracijom) i gel elektroforezom. Identifikacija proteina separiranih gel elektroforezom provodi se digestijom u gelu, analizom MALDI-MS/MS te pretragom baze podataka ili koristeći Western blot analizu.

Tekućinska kromatografija

BIOCentar nudi široki spektar tehnika za analizu proteina/peptida: gel filtraciju (engl. Size Exclusion Chromatography, SEC), kromatografiju obrnutih faza (engl. Reverse-Phase Liquid Chromatography, RP-HPLC) i kromatografiju ionskom izmjenom (engl. Ion Exchange Chromatography, IEX). Nakon separacije jednom od tehnika LC moguće je napraviti i MS analizu i identifikaciju proteina/peptida.

Sekvenciranje proteina/peptida

Usluga sekvenciranja proteina/peptida uključuje MALDI sekvenciranje tehnikom odozgo-nadolje (engl. Top-Down Sequencing, MALDI-TDS) ili de novo sekvenciranje peptida. MALDI-TDS omogućava informaciju o primarnoj strukturi proteina, uključujući i 70-ak aminokiselina s N- i C-kraja putem pretrage baze podataka dok se tehnikama de novo sekvenciranja pristupa za određivanje primarne strukture proteina koji nisu u bazi podataka. Sekvenciranje proteina u BIOCentru omogućava informaciju o primarnoj strukturi proteina koristeći kemijsko obilježavanje peptida te laserom induciranu fragmentaciju (LIFT) u spektrometru masa.

Aminokiselinska analiza

Aminokiselinska analiza omogućava određivanje sastava aminokiselina u proteinskim i peptidnim uzorcima, ali i u ostalim biološkim uzorcima koji sadrže primarne ili sekundarne aminogrupe unutar molekularne strukture. Aminokiselinska analiza omogućava kvantifikaciju slobodnih aminokiselina te kvantifikaciju ukupnih aminokiselina vezanih u makromolekule.

ANALIZA PROTEOMA

U istraživanjima proteoma pružamo usluge tekućinske kromatografije spregnute s tandemnom spektrometrijom masa (LC-MS/MS) u svrhu ciljanih i ne-ciljanih analiza.

Ne-ciljanje proteomske analize

Usluge ne-ciljane analize ili engl. “shotgun” uglavnom uključuju digestiju proteina u otopini koristeći specifične enzime. Dobivena smjesa peptida se separira koristeći nano-LC, a frakcije separiranih peptida se sakupljaju. Peptidne frakcije analiziraju se MALDI-TOF/TOF instrumentom, a dobiveni podaci uspoređuju se s bazom podataka kako bi se identificirali proteini. Fokus ne-ciljanih analiza je mapiranje proteina iz stanica ili tkiva, ali i determinacija promjena u ekspresiji proteina između uzoraka.

Ciljane proteomske analize

Uslugama ciljane proteomske analize nudimo determinaciju i kvantifikaciju specifičnih peptida u kompleksnoj proteinskoj smjesi. Za ovakve analize obično se koristi trostruki kvadrupol (engl. triple quadrupole mass spectrometer, QQQ). Ciljana proteomika se najčešće koristi pri utvrđivanju da li je određeni gen inaktiviran (engl. knockdown), za kvantifikaciju peptida/proteina u kompleksnim smjesama ili za praćenje količine specifičnog proteina u različitim uzorcima i/ili u jednom uzorku kroz dulje vrijeme.

ANALIZA STRUKTURE VIŠEG REDA PROTEINA

Cirkularni dikroizam (CD)

Tehnikom CD omogućavamo spektroskopsku analizu proteina u svrhu procjene sekundarne strukture (alfa uzvojnica i beta nabrana ploča).

Diferencijalna pretražna kalorimetrija

Diferencijalnom pretražnom kalorimetrijom omogućavamo mjerenje termodinamskih parametra proteina (npr. određivanje temperature mekšanja proteina) kako bi se odredila stabilnost proteina.

OPREMA

Jasco Europe CD/LD spektropolarimetar, GE Healthcare Life Science diferencijalna pretražna kalorimetrija, Thermo Fischer Sientific & Bruker Daltonics GmbH UHPLC – MALDI TOF/TOF, Agilent Technologies HPLC-DAD, Agilent Technologies HPLC-RID, Agilent Technologies HPLC-FLD, Agilent Technologies LC-(QQQ)-MS/MS

Laboratorij za pranje i sterilizaciju pruža uslugu pranja laboratorijskog posuđa u profesionalnim Smeg perilicama, koje imaju mnogobrojne programe pranja za različite vrste posuđa te različite vrste zaprljanja. Nakon pranja posuđe se suši ili sterilizira u suhom sterilizatoru Pol-Eko Apparatura.

U istoj jedinici pruža se i usluga autoklaviranja – sterilizacije u autoklavu Tuttnauer 66120-1 VEP, volumena komore 450 L. Autoklav ima različite programe tj. ima mogućnost programiranja tlaka, temperature i vremenskog perioda autoklaviranja, ovisno o vrsti materijala za sterilizaciju.

Nastali otpad iz mikrobiološkog laboratorija i laboratorija za staničnu biologiju se sterilizira-autoklavira i tako svodi na neškodljivu razinu prije uklanjanja.

Centralni laboratorij BIOCentra nudi korisnicima usluge analiza piva prilagođene craft pivovarama i kućnim pivarima koji žele kontrolirati kvalitetu svojih proizvoda.
Sve analize izvode se po EBC (European Brewery Convention) metodama.*

Usluge:

  • FIZIKALNO – KEMIJSKA ANALIZA koja uključuje: Određivanje pH, Udio alkohola (ABV), Određivanje gorčine (BU), Određivanje boje (EBC)
  • MIKROBIOLOŠKA ANALIZA koja uključuje: Testiranje prisutnosti najčešćih bakterijskih zagađivača u pivu (Genus ID), Identifikacija individualnih bakterijskih zagađivača u pivu (Species ID)
  • GLUTEN – Testiranje prisutnosti glutena u pivu

*Laboratorij ne izdaje certifikate analize.

Za sve informacije kontaktirajte nas na:

Kontakt telefon: (01) 645 8644, (01) 645 8642
E-mail: info@biocentre.hr