Centralni laboratorij

Djelatnice laboratorija za staničnu biologiju:

Dr. sc. Dora Markulin, voditeljica laboratorija, e-mail: dora.markulin@biocentre.hr
Mihaela Kordun, mag.biol.mol., stručna suradnica, e-mail: mihaela.kordun@biocentre.hr

Laboratorijske usluge:

Uzgoj i pohrana staničnih linija te razvoj i provedba analiza koristeći metode molekularne biologije (npr. PCR, qPCR, protočna citometrija).

Stanična kultivacija i molekularno-biološki testovi uključuju:

Uzgoj i čuvanje stanica

• Uzgoj humanih i animalnih staničnih linija (adherentne stanične linije i stanične linije u suspenziji)
• Pohrana humanih i animalnih staničnih linija u tekućem dušiku

Analiza i karakterizacija stanica

• Testiranje stanica na prisutnost mikoplazmi
• Analiza heterogene stanične populacije
• Identifikacija specifičnog tipa stanica
• Tretiranje stanica specifičnim supstancama

Molekularno-biološke tehnike

• Izolacija, detekcija i kvantifikacija DNA i RNA
• Analiza DNA i RNA metodama PCR i qPCR

Funkcionalne i biokemijske analize stanica

• Testovi vijabilnosti / citotoksičnosti
• Analiza apoptoze
• Analiza staničnog ciklusa
• Analiza stanične diferencijacije
• Kvantifikacija topivih supstanci u stanicama
• Ispitivanje prooksidativnog učinka supstanci

 

INSTRUMENTI I OPREMA

PCR i qPCR uređaji

• PCR uređaj, SimpliAmp Thermal Cycler, Applied Biosystems
• qPCR uređaj, AriaMX, Agilent Technologies

Protočni citometar i oprema za stanične analize

• Protočni citometar, BD FACSVerse, BD Biosciences
• Brojač stanica, Countess 3 Automated Cell Counter, Thermo Fisher Scientific
• Čitač mikrotitarskih pločica, Plate Chameleon V, Hidex

Mikroskop

• Invertni mikroskop, MCX1600, Micros Austria

Oprema za kultivaciju stanica

• CO₂ inkubatori za uzgoj staničnih kultura, Binder
• Mikrobiološki sigurnosni kabineti, EuroClone S@femate 1.2, BioAir

Oprema za centrifugiranje i spremnici

• Protočna centrifuga, Sorvall Centrifuge Stratos, Thermo Fisher Scientific
• Spremnik za tekući dušik, Arpege 110, Air liquid

Djelatnice laboratorija za izolaciju i pročišćavanje:

Dr.sc. Ana Smolko, viša stručna suradnica, e-mail: ana.smolko@biocentre.hr
Marija Ivić, mag. nutr., stručna suradnica, e-mail: marija.ivic@biocentre.hr 

Laboratorijske usluge:

Procesiranje biološkog materijala poput izolacije bioloških molekula, nativnih ili rekombinantnih proteina iz uzorka. Nudimo usluge optimizacije i skaliranja procesa od laboratorijskih do industrijskih mjera.

Izolacija i pročišćavanje smjesa

• Tehnikama tekuće preparativne kromatografije iz uzorka se odvajaju proteini ili male molekule. Ovisno o fizikalno-kemijskim svojstvima uzorka i analita koristi se prikladna vrsta tekućinske kromatografije – npr. ionska izmjena (engl. ion exchange), kromatografija isključenja (engl. size exclution chromatography), afinitetna kromatografija, kromatografija obrnutih faza (engl. reversed-phase chromatography) itd.
• Analizu je moguće provesti ciljano, tako da se iz uzorka izolira jedan ili više ciljanih analita, ili tako da se kompleksna smjesa razdvoji prema određenom svojstvu (recimo prema ionskoj jakosti ili veličini molekula) nakon čega se sakupe manje frakcije, spremne za daljnju karakterizaciju.

Ukoncentriravanje i dijafiltracija

• Primjena tangencijalne filtracije (engl. cross-flow) za ukoncentriravanje i izmjenu pufera u uzorcima velikog volumena (od 0.5 L do nekoliko desetaka litara).

Procesiranje na različitim skalama

• U laboratoriju se procesiranje može provoditi na različitim skalama – od manjih, laboratorijskih količina do većih količina na pilotnoj proizvodnoj skali. Metoda za izolaciju i pročišćavanje se razvija i optimizira na manjoj skali, a zatim se transferira na veću.

Optimizacija procesa pročišćavanja

• Laboratorij nudi uslugu optimizacije vašeg procesa za izolaciju ili pročišćavanje ciljanog proteina.

Proizvodnja i kontrola kvalitete proteina

• Mikrobiološki laboratorij nudi usluge proizvodnje rekombinantnih proteina, a Laboratorij za bioanalitiku II – Proteomika nudi kontrolu kvalitete proteina tijekom cijelog procesa – od optimizacije pročišćavanja do prijenosa na veću skalu.

 

INSTRUMENTI I OPREMA

Sustavi za preparativnu kromatografiju

• ÄKTA Pure 25, GE Healthcare Life Sciences
• ÄKTA Avant 25, GE Healthcare Life Sciences
• ÄKTA Avant 150, GE Healthcare Life Sciences
• ÄKTA Pilot, GE Healthcare Life Sciences

Sustav za tangencijalnu filtraciju

• SARTOFLOW Advanced, Sartorius

Oprema za centrifugiranje i termostatirani prostor

• Centrifuga, Sorvall Lynx 4000, Thermo Scientific
• Hladna soba s termostatiranom kontrolom temperature (4-8°C)

Djelatnice bioanalitičkog laboratorija I (kemija):

Jasna Jakovljević, dipl. ing., viša stručna suradnica, e-mail: jasna.jakovljevic@biocentre.hr

Diana Nejašmić Tušek, mag. ing., viša stručna suradnica, e-mail: dijana.nejasmic.tusek@biocentre.hr

Laboratorijske usluge:

Razvoj, optimizacija, prijenos i validacija analitičkih metoda za identifikaciju i kvantifikaciju sastojaka. Analize provodimo na biljnim materijalima, farmaceutskim, prehrambenim i biotehnološkim proizvodima, kao i na  biomedicinskim uzorcima. Koristimo napredne analitičke tehnike, uključujući spektroskopiju, kromatografiju i spektrometriju masa.

Analize biljnog materijala

• Razvoj metoda pripreme uzoraka i analize različitih biljnih dijelova, poput lista, plodova, sjemenki ili koštica.
• Analize bioaktivnih komponenti: ukupni i pojedinačni polifenoli, flavonoidi, ugljikohidrati, kondenzirani tanini, ukupne i pojedinačne organske kiseline, klorofil, vitamini topljivi u vodi, masne kiseline, karotenoidi, analize antioksidativne aktivnosti i dr.
• Aroma profili svježih i sušenih bilja te usporedni profili, kao i analize aroma u eteričnim uljima plinskom kromatografijom i spektrometrijom masa.

Analize farmacutskih, kemijskih i kozmetičkih proizvoda

• R&D analitička podrška razvoju i formulaciji proizvoda – analize sirovina i razvojnih formulacija, stabilitetne studije tijekom razvoja proizvoda, reverzni inženjering komponenti generičkih proizvoda te usporedba s orginatorom.
• Razvoji i validacije metoda za kvantifikaciju farmaceutskih djelatnih tvari (API), pomoćnih tvari, konzervansa i antioksidansa u sirovinama, poluproizvodima i gotovim proizvodima, te metoda za analizu sadržaja ostataka djelatne tvari pri procesu validacije čišćenja (ispirci i brisevi).
• Razvoji i validacije metoda, te analize sadržaja hlapljivih onečišćenja s tekućim ili „headspace“ injektiranjem. Primjerice, analize sadržaja alkohola i onečišćenja u različitim dezinficijensima.
• Razvoji i validacije metoda, te analize sadržaja onečišćenja nastalih otpuštanjem materijala kontaktne ambalaže primjenom tekućinske i/ili plinske kromatografije spregnute s tandemnom spektrometrijom masa.

Analize biotehnoloških proizvoda

• Ciljane metabolomske analize staničnih lizata i biomase.
• Metabolički neciljani profili spojeva nastalih metabolizmom različitih mikroorganizama.

Analize biomedicinskih uzoraka

• Ciljane analize toksičnih metabolita u biološkim tekućinama.
• Profili masnih kiselina u ljudskim biološkim tekućinama (krvni serum).
• Analiza ostataka krioprotektanta (dimetil sulfoksid) i ostataka antibiotika u fiziološkoj otopini nakon ispiranja tkiva i u samom tkivu

Analize pića

• Pive (pH, boja, gorčina i % alkohola), jakih alkoholnih pića (% alkohola i aroma profil), fermentacijski napitci (pH, kiselost, šećeri, fenoli, i dr.).

Analize hrane

• Analize proteinskih prahova (kemijske i proteomske analize).
• Ostale analize: akrilamida, biogenih amina u ribi i ribljim proizvodima, aroma profili mesa i mesnih prerađevina.

 

INSTRUMENTI I OPREMA

Sustavi za tekućinsku kromatografiju

• HPLC-DAD-UV/VIS, Agilent Technologies
• HPLC-RID, Agilent Technologies
• HPLC-FLD, Agilent Technologies
• UPLC-DAD-UV/VIS, Agilent Technologies

Sustavi za plinsku kromatografiju

• GC-FID, Agilent technologies

Sustavi spregnuti sa spektrometrijom masa

• UPLC-QQQ-MS/MS, Agilent Technologies
• UPLC-TripleTOF® 6600+ System, Sciex
• GC-MS/MS, Thermo Scientific

Sustavi za spektroskopiju

• UV/VIS spektrofotometar Agilent Technologies
• FLD spektrofotometar Agilent Technologies

Oprema za pripremu uzoraka i analizu

• Centrifuga, 21R Digicen
• Rotavapor, Hei-Vap, Heidolph Instruments GmbH
• Sustav za upravanje pod dušikom, REACTI-THERM III 18824, Thermo Scientific
• Mlin za usitnjavanje, Tube mill control 100, Ika
• Konduktometar, SD30 PURE H2O K, Mettler Toledo

Djelatnice bioanalitičkog laboratorija II (proteomika):

Vanja Kelava, mag. appl. chem., viša stručna suradnica, e-mail: vanja.kelava@biocentre.hr
Dr. sc. Karla Košpić, viša stručna suradnica, e-mail: karla.kospic@biocentre.hr
Rea Bertoša, mag. ing., stručna suradnica, e-mail: rea.bertosa@biocentre.hr
Željka Stanečić, mag. ing., stručna suradnica, e-mail: zeljka.stanecic@biocentre.hr

Laboratorijske usluge:

Karakterizacija pojedinačnih proteina te analiza kompleksnih proteinskih smjesa (ciljane i ne-ciljane analize). Provođenje analiza struktura višeg reda proteina.

KARAKTERIZACIJA PROTEINA

Mapiranje peptida

• Mapiranje masa peptida uključuje digestiju proteinske molekule koristeći specifične enzime, a zatim analizu dobivene smjese peptida koristeći metode tekućinske kromatografije (LC) i/ili spektrometrije masa (MS).
• Analize se mogu provesti direktnim MS mjerenjem ili putem spregnutih sustava tekućinske kromatografije i spektrometrije masa (LC-MS).
• Kako bi se dobila potvrda o primarnoj strukturi proteina, mapiranje peptida može biti prošireno pretragom baze podataka ili sekvenciranjem peptida de novo.

Analize molekulske mase

• Mjerenja intaktne molekulske mase proteina bazirane na MS metodama nude točnost u širokom području molekulskih masa. Direktne MS analize koriste se pri analizi pojedinačnih proteina, dok se u kompleksnim smjesama pristupa separaciji tekućinskom kromatografijom prije MS detekcije.
• Molekulska masa proteina te karakterizacija nečistoća u proizvodima biofarmaceutike može se provesti tekućinskom kromatografijom (gel filtracijom) i gel elektroforezom.
• Identifikacija proteina separiranih gel elektroforezom provodi se digestijom u gelu, MS analizom te pretragom baze podataka.

Analiza proteina/peptida tekućinskom kromatografijom

• Tehnike: gel filtracija (engl. Size Exclusion Chromatography, SEC), kromatografija obrnutih faza (engl. Reverse-Phase Liquid Chromatography, RP-HPLC) i kromatografija ionskom izmjenom (engl. Ion Exchange Chromatography, IEX).
• Nakon separacije jednom od tehnika LC moguće je napraviti i MS analizu i identifikaciju proteina/peptida.

Sekvenciranje proteina/peptida

• Uključuje sekvenciranje tehnikom odozgo-nadolje (engl. Top-Down Sequencing, TDS) ili de novo sekvenciranje peptida.
• TDS omogućava informaciju o primarnoj strukturi proteina, uključujući i 70-ak aminokiselina s N- i C-kraja putem pretrage baze podataka, dok se tehnikama de novo sekvenciranja pristupa pri određivanju primarne strukture proteina koji nisu u bazi podataka.
• Sekvenciranje proteina omogućava informaciju o primarnoj strukturi proteina koristeći kemijsko obilježavanje peptida te fragmentaciju u spektrometru masa.

Aminokiselinska analiza

• Određivanje sastava aminokiselina u proteinskim i peptidnim uzorcima, ali i u ostalim biološkim uzorcima koji sadrže primarne ili sekundarne amino grupe unutar molekularne strukture.
• Omogućava kvantifikaciju slobodnih i ukupnih aminokiselina vezanih u makromolekule.

Sadržaj proteina pomoću spektrofotometrijskih/fluorimetrijskih testova

• Koncentracija ukupnih proteina u uzorcima određuje se spektrofotometrijskim i fluorimetrijskim metodama, npr. Bradford i Pierce metoda.
• Za analize koje zahtijevaju visoku osjetljivost i točnost pri niskim koncentracijama proteina koristi se fluorimetrijska metoda Qubit koja smanjuje interferenciju ostalih biomolekula.

Ellmanov test

• Ellmanov test se koristi za određivanje koncentracije slobodnih tiolnih skupina u proteinima spektrofotometrijskim mjerenjem pri 412 nm. Koncentracija slobodnih tiolnih grupa u uzorku se određuje pomoću baždarne krivulje koja sadrži poznate koncentracije spojeva koji sadrže tiolne skupine, poput cisteina.

 

ANALIZA PROTEOMA

U istraživanjima proteoma pružamo usluge tekućinske kromatografije spregnute s tandemnom spektrometrijom masa (LC-MS/MS) u svrhu ciljanih i ne-ciljanih analiza.

Ne-ciljane proteomske analize

• Usluge ne-ciljane analize (engl. shotgun proteomics) uglavnom uključuju digestiju proteina u otopini ili gelu koristeći proteolitičke enzime.
• Dobivena smjesa peptida se separira koristeći nano-LC u sprezi s spektrometrom masa TripleTOF 6600+.
• Koristimo dva pristupa: podatkovno ovisnu analizu (engl. data-dependent acquisition, DDA) i podatkovno neovisnu analizu (engl. data-independent acquisition, DIA). Pristup DDA je uglavnom usmjeren na identifikaciju proteina u uzorku te za izgradnju spektralnih knjižnica, dok je pristup DIA fokusiran na relativnu kvantitativnu analizu proteina između dva ili više uzoraka.

Ciljane proteomske analize

• Usluge ciljane proteomske analize (engl. targeted proteomics) uključuju identifikaciju i kvantifikaciju specifičnih peptida u kompleksnoj proteinskoj smjesi primjenom tekućinske kromatografije spregnute s tandemnom spektrometrijom masa (LC-MS/MS).
• Ciljana proteomika se najčešće koristi pri utvrđivanju je li određeni gen inaktiviran (engl. knockdown), za kvantifikaciju odabranih peptida/proteina u kompleksnim smjesama ili za praćenje količine specifičnog proteina u različitim uzorcima i/ili u jednom uzorku kroz dulje vrijeme.

 

ANALIZA STRUKTURE VIŠEG REDA PROTEINA

Cirkularni dikroizam (CD)

• Tehnikom CD omogućavamo spektroskopsku analizu proteina u svrhu procjene sekundarne strukture (alfa uzvojnica i beta nabrana ploča).

 

INSTRUMENTI I OPREMA

Spektrometrija masa

• TripleTOF® 6600+ System, Sciex
• MALDI TOF/TOF, Bruker Daltonics GmbH
• LC-(QQQ)-MS/MS, Agilent Technologies

Tekućinska kromatografija

• UHPLC-DAD-UV/VIS Thermo Fisher Scientific
• HPLC-DAD-UV/VIS, Agilent Technologies
• HPLC-RID, Agilent Technologies
• HPLC-FLD, Agilent Technologies

Spektroskopija

• Jasco Europe CD/LD spektropolarimetar

Oprema za centrifugiranje

• Centrifuga bez hlađenja, mySPIN 12, Thermo Fisher Scientific
• Centrifuga s hlađenjem, Centric 200 R, Tehtnica
• Mini-Centrifuge/Vortex Combi-Spin, FVL-2400N, Biosan

Oprema za pripremu uzoraka

• Concentrator plus, 5305000304, Eppendorf
• Homogenizator, SHM1, Stuart
• Digital Dry Bath, D1200, Labnet
• Digital Heating Shaking Drybath, Thermo Fisher Scientific

 

Djelatnice:

Željka Hodinj, kem.tehn., e-mail: zeljka.hodinj@biocentre.hr
Anita Rustan, bacc.ing.sec., e-mail: anita.rustan@biocentre.hr

Usluge:

• Pranje laboratorijskog posuđa u profesionalnim Smeg GW4090C perilicama prilagođeno vrsti posuđa i razini zaprljanja, a zatim sušenja ili sterilizacija laboratorijskog posuđa u suhom sterilizatoru Pol-Eko Apparatura.
• Autoklaviranje / sterilizacija u autoklavima koji imaju mogućnost programiranja tlaka, temperature i trajanja procesa, ovisno o vrsti materijala koji se sterilizira.
• Zbrinjavanje laboratorijskog otpada u skladu s važećim zakonima i propisima kao i principima zelene kemije.

OPREMA

• Laboratorijske perilice suđa, GW4090C & Access, Smeg
• Autoklav, Europe BV, 66120-1, zapremina 450 L, Tuttnauer
• Autoklav, Europe BV, 3870 ELDV, zapremina 85 L, Tuttnauer
• Suhi sterilizator, SRW 240 STD, Pol-Eko