Centralni laboratorij

Vrhunski opremljen Centralni laboratorij nudi sve sadržaje nužne za provedbu R&D projekata putem ugovornog istraživanja.

Sastoji se od 6 laboratorijskih jedinica:

Usluge Mikrobiološkog laboratorija usmjerene su na proizvodnju i pročišćavanje rekombinantnih proteina (µg do mg), te sam razvoj procesa proizvodnje proteina, biofarmaceutika i bio-sličnih lijekova.

Mikrobiološki laboratorij provodi i praktičnu edukaciju o rukovanju i primjeni više sustava za fermentaciju: 2 do 30 litarskih, te paralelnih 12 x 0,5 L fermentora. Podučavamo i različite tehnike kloniranja, te standardne mikrobiološke metode. Nudimo uzgoj i održavanje kultura bakterija i kvasaca.

TRANSFORMACIJA BAKTERIJSKIH STANICA

Kompetentne stanice E.coli transformiramo metodom toplinskog šoka kako bi unijeli vektor sa željenom DNA. Transformirane stanice odaberemo na selektivnoj agarnoj podlozi te pripremamo uzorak stanica u glicerolu za duboko zamrzavanje i daljnje korištenje.

UMNAŽANJE I PROČIŠĆAVANJE PLAZMIDA

Kompetentne stanice E.coli transformiramo željenom DNA. Nakon izolacije DNA (mini, midi ili maxi prep) provodimo kontrolu kvalitete koja uključuje: razdvajanje DNA na agaroznom gelu, omjer absorbancije A260/280 i kvantifikaciju.

PROIZVODNJA PROTEINA U E. COLI ILI KVASCIMA

Proizvodnja rekombinantnih proteina započinje transformacijom i uzgojem stanica u odabranim uvjetima. Izvedba fermentacije može biti u tikvama od 0,1-1L, ili u fermentorima od 0,5L (do 12 istovremeno), 2 L (2 istovremeno) ili 30L. Prije fermentacije većih količina (2-30L) provodimo testnu proizvodnju u volumenu od 0,1L. Kako bi povećali prinos rekombinantnog proteina optimiziramo uvjete proizvodnje izborom hranjivog medija, izvora ugljika, temperature, pH, prozračivanja, koncentracije kemijskog induktora proizvodnje proteina te trajanjem proizvodnje.

PROČIŠĆAVANJE PROTEINA

Usluga našeg Laboratorija za izolaciju i pročišćavanje.
Proces uključuje razbijanje stanica (visokotlačnim ili ultrazvučnim homogenizatorom), razdvajanje, izolaciju i pročišćavanje proteina. Laboratorij nudi i koncentriranje uzoraka ili dijafiltraciju (odsoljavanje i zamjena pufera).

KVALITETA KONTROLE PROTEINA

Usluga našeg Laboratorija za bioanalitiku – proteomiku.
Laboratorij nudi SDS-PAGE i western-blot analizu proteina tijekom cijelog proizvodnog procesa – od optimizacije do proizvodnje velikih količina proteina. Uključuje i spektrometrijsku kvantifikaciju (NanoDrop), te identifikaciju proteina metodom LC-MS/MS.

MOLEKULARNA BIOLOGIJA

Osim izolacije proteina provodimo i izolaciju DNA i RNA iz stanica mikroorganizama. Metodom lančane reakcije polimerazom (PCR) možemo detektirati i ciljano identificirati mikroorganizme u raznim uzorcima, primjerice probioticima ili pivu.

INSTRUMENTI I OPREMA

Sartorius BIOSTAT Qplus 12 x 0.5L MO, BIOSTAT B Twin 2L MO, BIOSTAT Cplus 30L MO; visokotlačni homogenizator Panda Plus, Geo Niro Savi; ultrazvučni homogenizator Bandelin, Sonoplus; NanoDrop One, Thermo Scientific; protočna centrifuga Sorval Stratos.

Laboratorij za staničnu biologiju nudi slijedeće usluge:

1. Protočna citometrija (BD FACSVerse, FACSuite, 3 lasera, 8 fluorokroma po uzorku)

  • Imunofenotip
  • Hematološke analize (fenotipiziranje leukemija i limfoma, leukocitni površinski marker, identifikacija prognostički važnih podskupina, brojanje hematopoetskih progenitorskih stanica), sistemska mastocitoza, brojanje retikulocita, autoimuni I aloimuni poremećaji (anti-trombocitna protutijela IgG, IgM, anti-neutrofilna protutijela IgG, imuno kompleksi), površinski markeri eritrocita, procjena kontaminiranosti krvnih uzoraka leukocitima (FS, SS, leukocitni površinski markeri), paroksimalna noćna hemoglobinurija
  • Studije imunodeficijencije, transplantacijsko odbacivanje
  • Specifični humani ili animalni površinski ili unutarstanični markeri
  • Validacija staničnih linija
  • Testovi apoptoze/vijabilnosti
  • Vizualizacija fluorescentnih proteina
    Mjerenje proliferacijskih markera
  • Kemotaksa
  • Polimerizacija aktina
  • Analiza sadržaja DNA
  • Aktivnosti kaspaza

2. Stanične kulture

  • Uzgoj i održavanje humanih i animalnih staničnih linija
  • Primarne kulture
  • Ko-kulture, 3D kulture
  • Generiranje potpornih stanica (poput „Nurse like cells“) za in vitro stanične modele
  • Citotoksičnost, stanični proliferacijski testovi (MTT, izravni kontakt, itd.)
  • Zamrzavanje/odmrzavanje stanica i usluge banke stanica (tekući dušik)

3. Molekularna biologija

  • DNK, RNK i proteinski ekstrakti iz tkiva, staničnih suspenzija, krvi, koštane srži i sl.
  • Western blot
  • PCR (ARMS, cDNK retrotranskripcija, itd.)
  • ELISA
  • Generiranje lentiviralnih vektora
  • Tranzijentna i stabilna transfekcija
  • CRISPR/CAS9 metoda za editiranje genoma

4. Bioreaktori

Uzgoj staničnih kultura u laboratorijskom i industrijskom mjerilu; ekspresija, proizvodnja i pročišćavanje rekombinantnih proteina (protutijela, citokini itd.)

Laboratorij za izolaciju i pročišćavanje pruža usluge pročišćavanja i izolacije malih molekula te proteina.

Pročišćavanje proteina uključuje brojne metode za izolaciju nativnih ili rekombinantnih proteina iz stanica ili biološkog materijala.

HOMOGENIZACIJA

Izolacija proteina i metabolita iz stanica koristeći metode za razaranje stanica: kuglične metode (staklene kuglice), homogeniziranje pod visokim tlakom ili homogeniziranje ultrazvukom.

TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA I SAKUPLJANJE FRAKCIJA

Razvoj metoda i procesa koristeći sustave za preparativnu kromatografiju s automatiziranim sakupljačima frakcija. Separacija i pročišćavanje proteina i malih molekula može biti provedena na visokoselektivnim kolonama s visokom rezolucijom (SEC, IEX, RP i afinitetna kromatografija). Mogućnost sakupljanja frakcija ovisno o vremenu ili volumenu te sakupljanja frakcija samo određenih kromatografskih pikova.

FILTRACIJA

Tangencijalna protočna filtracija (engl. tangential flow filtration, TFF) za separaciju i pročišćavanje malih molekula, proteina i staničnih suspenzija. TFF možemo koristiti za koncentriranje uzoraka ili dijafiltraciju (odsoljavanje i zamjena pufera) u volumnim rasponima od 25 mL do nekoliko desetaka litara. Također, ovom metodom možemo razdvojiti velike molekule od malih, ukloniti stanični medij ili izdvojiti stanični lizat od fermentacijskog medija.

OPTIMIZACIJA PROCESA

Mogućnosti naših instrumenata omogućavaju brz razvoj metoda te provođenje kromatografskih procesa na različitim skalama što je idealno za razvoj proizvodnih procesa biofarmaceutika. Optimizacija pokretnih faza te optimizacija separacijske metode može se provesti na maloj laboratorijskoj skali te se može povećati do probne (pilot) proizvodne skale. Na većim skalama omogućavamo dodatno podešavanje parametara metoda uz testiranje robusnosti procesa koristeći velike kolone.

INSTRUMENTI I OPREMA

High pressure homogenizer Panda Plus, Geo Niro Savi; ultrasonic homogenizer Bandelin, Sonoplus; GE Healthcare Life Sciences ÄKTA avant 25, ÄKTA Avant 150, and ÄKTA Pilot; AKTA Crossflow and Sartorius SARTOFLOW Advanced.

Bioanalitički laboratorij I (kemija) BICRO BIOCentra pruža usluge razvoja, optimizacije, transfera i / ili validacije analitičkih metoda koristeći sljedeće tehnike:

  • UV/VIS i fluorescentne spektroskopije
  • tekućinske kromatografije: UHPLC-UV/VIS, HPLC-RID, HPLC-FLD, LC-(QQQ)-MS/MS
  • plinske kromatografije: GC-(Ionska stupica)-MS/MS.

Bioanalitički laboratorij I (kemija) Vam može pomoći kao laboratorijska podrška u istraživanju i razvoju te postizanju veće kvalitete proizvoda za postizanje bolje karakterizacija biomolekula ili lijekova, bilo u području akademskih istraživanja ili za industrijske primjene.

Uz korištenje HPLC uređaja vezanog na UV/VIS (DAD) detektor, možemo vam pružiti uslugu razvoja kvantitativne metode za određivanje sadržaja širokog spektra spojeva u području biofarmaceutika, hrane, agrokemikalija, kozmetike ili uzoraka iz okoliša. Primjerice, možemo vam pružiti uslugu razvoja metode za brojne biološki aktivne tvari, razgradne produkte (onečišćenja), konzervanse, antioksidanse, aditive, vitamine topljive u vodi, organske kiseline, biomolekule (hormone, proteine, peptide, i sl.).
Sadržaj šećera, alkohola i složenih ugljikohidrata može se odrediti koristeći HPLC uređaja vezanog na detektor INDEKSA REFRAKCIJE (RID).

Spojevi koji prirodno fluoresciraju (primjerice policiklički aromatski ugljikovodici) kao i fluorescentni spojevi dobiveni pred kolonskom derivatizacijom (bioaktivni peptidi, tragovi lijekova, i sl.) mogu se analizirati sa HPLC vezanim na FLUORESCENTNI detektor.

Određivanje aroma (aroma profil) hrane, pića, napitaka, začina i mirisa može se provesti uz pomoć manualnog Head-Space–Solid Phase Micro Extraction vlaknima i analizom na GC-MS/MS instrumentu.
Nadalje, GC-MS/MS kvalitativna (relativno kvantitativna) i / ili kvantitativna analiza brojnih spojeva može se odrediti korištenjem automatskog „split/splitless“ injekcijskog sustava. Primjerice, određivanje hlapljivih organskih spojeva, onečišćenja u tragovima, estera, masnih kiselina, alkohola, aldehida, terpena, zagađivala u hrani, sastav esencijalnih ulja (lavandinog, limunovog ulja i sl.), parfema, mentola, itd.
Možemo vam pružiti uslugu razvoja GC-MS/MS metoda za određivanje metaboličkih profila; identifikacija spojeva nastalih metabolizmom mikroorganizmima, metabolita u serumu, profili masnih kiselina. Isto tako možemo detektirati hlapljive lipofilne spojeve u biljnim vrstama.

Za ciljane analize, možemo razviti LC-MS/MS metode za kvantifikaciju tragova organskih spojeva u kompleksnim matriksima: istraživanjima kvalitete i sigurnosti hrane, studije uzoraka iz okoliša, istraživanja metabolita lijekova, toksikologije, forenzike i bioanalize.

Bioanalitički laboratorij II (proteomika) pruža mnoštvo usluga, od karakterizacije pojedinačnih proteina do analiza kompleksnih proteinskih smjesa (putem ciljanih i ne-ciljanih analiza).

Bioanalitički laboratorij II (proteomika) također može osigurati i analizu strukture višeg reda proteina.

KARAKTERIZACIJA PROTEINA

Mapiranje peptida

Mapiranje masa peptida uključuje fragmentaciju proteinske molekule koristeći specifične enzime, a zatim analizu dobivene smjese peptida spektrometrije masa (MS). Analize mogu biti napravljene direktnim MS mjerenjem ili putem spregnutih sustava tekućinske kromatografije i spektrometrije masa (LC-MS). Kako bi se dobila potvrda o primarnoj strukturi proteina, mapiranje peptida može biti prošireno pretragom baze podataka ili sekvenciranjem peptida de novo.

Analize molekulske mase

Mjerenja intaktne molekulske mase proteina bazirane na MS metodama nude točnost u mjerenju u širokom području molekulskih masa. Direktne MALDI-MS analize koriste se pri analizi pojedinačnih proteina, dok se u kompleksnim smjesama pristupa separaciji tekućinskom kromatografijom prije MALDI-MS detekcije. Molekulska masa proteina te karakterizacija nečistoća u proizvodima biofarmaceutike može se provesti i gel elektroforezom. Identifikacija proteina separiranih gel elektroforezom provodi se digestijom u gelu, analizom MALDI-MS/MS te pretragom baze podataka ili koristeći Western blot analizu.

Tekućinska kromatografija

BIOCentar nudi široki spektar tehnika za analizu proteina/peptida: gel filtraciju (engl. Size Exclusion Chromatography, SEC), kromatografiju obrnutih faza (engl. Reverse-Phase Liquid Chromatography, RP-HPLC) i kromatografiju ionskom izmjenom (engl. Ion Exchange Chromatography, IEX). Nakon separacije jednom od tehnika LC moguće je napraviti i MS analizu i identifikaciju proteina/peptida.

Sekvenciranje proteina/peptida

Usluga sekvenciranja proteina/peptida uključuje MALDI sekvenciranje tehnikom odozgo-nadolje (engl. Top-Down Sequencing, MALDI-TDS) ili de novo sekvenciranje peptida. MALDI-TDS omogućava informaciju o primarnoj strukturi proteina, uključujući i 70-ak aminokiselina s N- i C-kraja putem pretrage baze podataka dok se tehnikama de novo sekvenciranja pristupa za određivanje primarne strukture proteina koji nisu u bazi podataka. Sekvenciranje proteina u BIOCentru omogućava informaciju o primarnoj strukturi proteina koristeći kemijsko obilježavanje peptida te laserom induciranu fragmentaciju (LIFT) u spektrometru masa.

ANALIZA PROTEOMA

Gel elektroforeza

Uslugama gel elektroforeze nudimo separaciju kompleksnih proteinskih smjesa tehnikama 1-DE ili 2-DE SDS-PAGE te vizualizaciju i relativnu kvantifikaciju koristeći denzitometrijske analize između različitih proteinskih uzoraka. Identifikacija proteina separiranih gel elektroforezom može se provesti digestijom u gelu, analizom MALDI-MS te pretragom baze podataka ili koristeći Western blot analizu.

Tekućinska kromatografija spregnuta s tandemnom spektrometrijom masa (LC-MS/MS)

U istraživanjima proteoma pružamo usluge LC-MS/MS u svrhu ciljanih i ne-ciljanih analiza.

Ne-ciljanje proteomske analize

Usluge ne-ciljanje analize ili engl. “shotgun” uglavnom uključuju digestiju proteina u gelu koristeći specifične enzime. Dobivena smjesa peptida se separira koristeći nano-LC, a frakcije separiranih peptida se sakupljaju. Peptidne frakcije analiziraju se MALDI-TOF/TOF instrumentom, a dobiveni podaci uspoređuju se s bazom podataka kako bi se identificirali proteini. Fokus ne-ciljanih analiza je mapiranje proteina iz stanica ili tkiva, ali i determinacija promjena u ekspresiji proteina između uzoraka.

Ciljane proteomske analize

Uslugama ciljane proteomske analize nudimo determinaciju i kvantifikaciju specifičnih peptida u kompleksnoj proteinskoj smjesi. Za ovakve analize obično se koristi trostruki kvadrupol (engl. triple quadrupole mass spectrometer, QQQ). Ciljana proteomika se najčešće koristi pri utvrđivanju da li je određeni gen inaktiviran (engl. knockdown), za kvantifikaciju peptida/proteina u kompleksnim smjesama ili za praćenje količine specifičnog proteina u različitim uzorcima i/ili u jednom uzorku kroz dulje vrijeme.

ANALIZA STRUKTURE VIŠEG REDA PROTEINA

Cirkularni dikroizam (CD)

Tehnikom CD omogućavamo spektroskopsku analizu proteina u svrhu procjene sekundarne strukture (alfa uzvojnica i beta nabrana ploča).

Diferencijalna pretražna kalorimetrija

Diferencijalnom pretražnom kalorimetrijom omogućavamo mjerenje termodinamskih parametra proteina (npr. određivanje temperature mekšanja proteina) kako bi se odredila stabilnost proteina.

Laboratorij za pranje i sterilizaciju pruža uslugu pranja laboratorijskog posuđa u profesionalnim Smeg perilicama, koje imaju mnogobrojne programe pranja za različite vrste posuđa te različite vrste zaprljanja. Nakon pranja posuđe se suši ili sterilizira u suhom sterilizatoru Pol-Eko Apparatura.

U istoj jedinici pruža se i usluga autoklaviranja – sterilizacije u autoklavu Tuttnauer 66120-1 VEP, volumena komore 450 L. Autoklav ima različite programe tj. ima mogućnost programiranja tlaka, temperature i vremenskog perioda autoklaviranja, ovisno o vrsti materijala za sterilizaciju.

Nastali otpad iz mikrobiološkog laboratorija i laboratorija za staničnu biologiju se sterilizira-autoklavira i tako svodi na neškodljivu razinu prije uklanjanja.

Centralni laboratorij BIOCentra nudi korisnicima usluge analiza piva prilagođene craft pivovarama i kućnim pivarima koji žele kontrolirati kvalitetu svojih proizvoda.
Sve analize izvode se po EBC (European Brewery Convention) metodama.*

Usluge:

  • FIZIKALNO – KEMIJSKA ANALIZA koja uključuje: Određivanje pH, Udio alkohola (ABV), Određivanje gorčine (BU), Određivanje boje (EBC)
  • MIKROBIOLOŠKA ANALIZA koja uključuje: Testiranje prisutnosti najčešćih bakterijskih zagađivača u pivu (Genus ID), Identifikacija individualnih bakterijskih zagađivača u pivu (Species ID)
  • GLUTEN – Testiranje prisutnosti glutena u pivu

*Laboratorij ne izdaje certifikate analize.

Za sve informacije kontaktirajte nas na:

Kontakt telefon: (01) 645 8644, (01) 645 8642
E-mail: info@biocentre.hr