Bioanalitički laboratorij II (proteomika)

Bioanalitički laboratorij II (proteomika) pruža mnoštvo analiza, od karakterizacije pojedinačnih proteina do analiza kompleksnih proteinskih smjesa (putem ciljanih i ne-ciljanih analiza). Bioanalitički laboratorij II (proteomika) također može osigurati i analizu strukture višeg reda proteina.
 
KARAKTERIZACIJA PROTEINA 

Mapiranje peptida
Mapiranje masa petida uključuje fragmentaciju proteinske molekule koristeći specifične enzime, a zatim analizu dobivene smjese peptida spektrometrom masa (MS). Analize mogu biti napravljene direktnim MS mjerenjem ili putem spregnutih sustava tekućinske kromatografije i spektrometra masa (LC-MS). Kako bi se dobila potvrda o primarnoj strukturi proteina, mapiranje peptida može biti prošireno pretragom baze podataka ili sekvenciranjem peptida de novo.
 
Analize molekulske mase
Mjerenja intaktne molekulske mase proteina bazirane na MS metodama nude točnost u mjerenju u širokom području molekulskih masa. Direktne MALDI-MS analize koriste se pri analizi pojedinačnih proteina, dok se u kompleksnim smjesama pristupa separaciji tekućinskom kromatografijom prije MALDI-MS detekcije.
 
Gel elektroforeza
Uslugama gel elektroforeze nudimo mjerenje molekulske mase proteina i karakterizaciju nečistoća u proizvodima biofarmaceutike. Također nudimo i istraživanja ekspresije celularnih proteina kombinacijom izoelektričnog fokusiranja (IEF) i SDS-PAGE (2-DE). Identifikacija proteina separiranih gel elektroforezom može se provesti digestijom u gelu, analizom MALDI-MS te pretragom baze podataka ili koristeći Western blot analizu.
 
Tekućinska kromatografija 
BIOCentar nudi široki spektar tehnika za analizu proteina/peptida: gel filtraciju (engl. Size Exclusion Chromatography, SEC), kromatografiju obrnutih faza (engl. Reverse-Phase Liquid Chromatography, RP-HPLC) i kromatografiju ionskom izmjenom (engl. Ion Exchange Chromatography, IEX). Nakon separacije jednom od tehnika LC moguće je napraviti i MS analizu i identifikaciju proteina/peptida.  
 
Sekvenciranje proteina/peptida
Usluga sekvenciranja proteina/peptida uključuje MALDI sekvenciranje tehnikom odozgo-nadolje (engl. Top-Down Sequencing, MALDI-TDS) ili de novo sekvenciranje peptida. MALDI-TDS omogućava informaciju o primarnoj strukturi proteina, uključujući i 70-ak aminokiselina s N- i C-kraja putem pretrage baze podataka dok se tehnikama de novo sekvenciranja pristupa za određivanje primarne strukture proteina koji nisu u bazi podataka. Sekvenciranje proteina u BIOCentru omogućava informaciju o primarnoj strukturi proteina koristeći kemijsko obilježavanje peptida te laserom induciranu fragmentaciju (LIFT) u spektrometru masa.
 
 
ANALIZA PROTEOMA

Gel elektroforeza
Uslugama gel elektroforeze nudimo separaciju kompleksnih proteinskih smjesa tehnikama 1-DE ili 2-DE SDS-PAGE te vizualizaciju i relativnu kvantifikaciju koristeći denzitometrijske analize između različitih proteinskih uzoraka. Identifikacija proteina separiranih gel elektroforezom može se provesti digestijom u gelu, analizom MALDI-MS te pretragom baze podataka ili koristeći Western blot analizu.
 
Tekućinska kromatografija spregnuta s tandemnom spektrometrijom masa (LC-MS/MS) 
U istraživanjima proteoma pružamo usluge LC-MS/MS u svrhu ciljanih i ne-ciljanih analiza.
 
Ne-ciljanje proteomske analize
Usluge ne-ciljanje analize ili engl. “shotgun” uglavnom uključuju digestiju proteina u gelu koristeći specifične enzime. Dobivena smjesa peptida se separira koristeći nano-LC, a frakcije separiranih peptida se sakupljaju. Peptidne frakcije analiziraju se MALDI-TOF/TOF instrumentom, a dobiveni podaci uspoređuju se s bazom podataka kako bi se identificirali proteini. Fokus ne-ciljanih analiza je mapiranje proteina iz stanica ili tkiva, ali i determinacija promjena u ekspresiji proteina između uzoraka.
 
Ciljane proteomske analize
Uslugama ciljane proteomske analize nudimo determinaciju i kvantifikaciju specifičnih peptida u kompleksnoj proteinskoj smjesi. Za ovakve analize obično se koristi trostruki kvadrupul (engl. triple quadrupole mass spectrometer, QQQ). Ciljana proteomika se najčešće koristi pri utvrđivanju da li je određeni gen inaktiviran (engl. knockdown), za kvantifikaciju peptida/proteina u kompleksnim smjesama ili za praćenje količine specifičnog proteina u različitim uzorcima i/ili u jednom uzorku kroz dulje vrijeme.
  

ANALIZA STRUKTURE VIŠEG REDA PROTEINA
 
Cirkularni dikroizam (CD)
Tehnikom CD omogućavamo spektroskopsku analizu proteina u svrhu procjene sekundarne strukture (alfa uzvojnica i beta nabrana ploča).
 
Diferencijalna pretražna kalorimetrija 
Diferencijalnom pretražnom kalorimetrijom omogućavamo mjerenje termodinamskih parametra proteina (npr. određivanje temperature mekšanja proteina) kako bi se odredila stabilnost proteina.